Uno schema altamente efficiente per la preparazione della biblioteca da un singolo

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13913 (2023) Citare questo articolo

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Sebbene i metodi per il sequenziamento della preparazione delle librerie dal DNA a doppio filamento siano ben consolidati, quelli dal DNA a singolo filamento (ssDNA) non sono stati ben studiati. Inoltre, i metodi esistenti presentano limitazioni in termini di efficienza e resa. Pertanto, abbiamo sviluppato una procedura altamente efficiente per il sequenziamento della preparazione delle librerie da ssDNA. In questo metodo, la prima codifica dell'adattatore di ssDNA viene eseguita utilizzando la legatura ssDNA (TACS) mediata dal connettore adenilato assistita da deossiribonucleotidil transferasi terminale (TdT), che abbiamo segnalato di recente. Dopo la sintesi del filamento complementare utilizzando l'ssDNA contrassegnato con l'adattatore, viene eseguita la seconda etichettatura dell'adattatore tramite la legatura dell'adattatore basata sulla topoisomerasi I del virus Vaccinia (VTopoI o TOPO). Con passaggi aggiuntivi per la degradazione, la repressione e la rimozione del dimero dell'adattatore, lo schema TACS-TOPO proposto realizza la preparazione della libreria di sequenziamento priva di dimero dell'adattatore da campioni di ssDNA di 24 pg. Lo schema TACS-TOPO è stato applicato con successo all'analisi del DNA privo di cellule con preparazione di librerie prive di amplificazione da 50 µl di siero umano. Uno schema TACS-TOPO modificato è stato applicato anche al DNA estratto da antiche ossa umane, ottenendo una resa delle librerie da due a otto volte maggiore rispetto a quelle che utilizzano un protocollo di preparazione delle librerie convenzionale. Vengono inoltre descritte le procedure per preparare VTopoI e il suo complesso con un adattatore oligonucleotidico a doppio filamento. Nel complesso, lo schema TACS-TOPO proposto può facilitare l'analisi pratica e sensibile del sequenziamento dello ssDNA.

Sebbene siano disponibili molti metodi efficienti per il sequenziamento della preparazione delle librerie dal DNA a doppio filamento (dsDNA)1,2,3, sono riportati metodi limitati per il DNA a filamento singolo (ssDNA). Ad oggi sono stati stabiliti solo tre principi principali per il sequenziamento della preparazione delle librerie da ssDNA. Il primo approccio prevede la coda omopolimerica mediata dalla deossiribonucleotidil transferasi (TdT) terminale all'estremità 3′ del ssDNA; la coda viene quindi utilizzata come sito di priming per convertire lo ssDNA bersaglio in dsDNA, seguito dal secondo adattatore che viene marcato con T4 DNA ligasi4. La preparazione delle librerie mediata da TdT è altamente efficiente e alcuni produttori forniscono kit di preparazione delle librerie basati su questo principio. Tuttavia, una coda lunga può costituire un ostacolo per l'analisi di sequenziamento a valle.

Il secondo metodo si basa sulla legatura dello ssDNA catalizzata dalla RNA ligasi, che unisce un adattatore 5′-fosforilato all'estremità 3′ dello ssDNA. Ad esempio, il gruppo di Meyer ha creato un metodo basato su CircLigase II5,6. Dopo la legatura dell'adattatore, ssDNA viene convertito in dsDNA, seguito dalla seconda etichettatura dell'adattatore da parte della DNA ligasi T4. Sebbene la RNA ligasi possa collegare due molecole di ssDNA, l'efficienza della reazione è limitata a meno di una piccola percentuale. Pertanto, la resa della preparazione della libreria utilizzando la RNA ligasi è piuttosto limitata.

Il terzo approccio utilizza la ligasi del DNA T4 per la legatura dello ssDNA7. In questo metodo viene utilizzato un adattatore a doppio filamento con un esamero casuale a filamento singolo a un'estremità. Se l'esamero casuale è ibridato in modo compatibile con l'estremità dell'ssDNA bersaglio, l'incisione sull'estremità parzialmente a doppio filamento dell'adattatore può essere sigillata con la DNA ligasi T4. Questa procedura basata sulla legatura splintata è chiamata ssDNA2.0 e mostra un'efficienza superiore al metodo basato su CircLigase II7. Sebbene entrambi i metodi basati sulla RNA ligasi e sulla T4 DNA ligasi possano produrre connessioni pulite con lo ssDNA target, resta da affrontare la loro bassa efficienza nella preparazione delle librerie.

Per migliorare la preparazione della libreria di sequenze da ssDNA, abbiamo sviluppato una tecnica per l'efficiente etichettatura dell'adattatore di ssDNA, denominata legatura del DNA a filamento singolo (ss) mediata da connettore adenilato terminale deossiribonucleotidil transferasi (TdT) assistita8. Nella legatura TACS, lo ssDNA target viene prima munito di alcuni adenilati utilizzando TdT in un processo chiamato ribotailing, seguito dall'etichettatura dell'adattatore mediata dalla RNA ligasi dello ssDNA a coda di ribota. Il ribotailing dell'estremità 3' dello ssDNA gli consente di comportarsi come RNA, il che migliora notevolmente l'efficienza della legatura dello ssDNA delle RNA ligasi. Di conseguenza, la legatura TACS consente la codifica dell'adattatore di oltre l'80% dell'estremità 3′ del target ssDNA8. In particolare, la reazione di coda di TdT con il ribonucleotide viene autoinibita dopo l'estensione di 1-3 nucleotidi9, il che si traduce in un'interruzione solo minima dell'analisi di sequenziamento a valle.