Autoregolazione della segnalazione GPCR attraverso il terzo loop intracellulare

Natura volume 615, pagine 734–741 (2023) Citare questo articolo

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Il terzo anello intracellulare (ICL3) della piega del recettore accoppiato a proteine ​​G (GPCR) è importante per il processo di trasduzione del segnale a valle dell'attivazione del recettore1,2,3. Nonostante ciò, la mancanza di una struttura definita di ICL3, combinata con la sua elevata divergenza di sequenza tra i GPCR, complica la caratterizzazione del suo coinvolgimento nella segnalazione recettoriale4. Precedenti studi incentrati sul recettore adrenergico β2 (β2AR) suggeriscono che ICL3 è coinvolto nel processo strutturale di attivazione e segnalazione del recettore5,6,7. Qui ricaviamo intuizioni meccanicistiche sul ruolo di ICL3 nella segnalazione β2AR, osservando che ICL3 autoregola l'attività del recettore attraverso un equilibrio conformazionale dinamico tra stati che bloccano o espongono il sito di legame della proteina G del recettore. Dimostriamo l'importanza di questo equilibrio per la farmacologia del recettore, dimostrando che gli effettori mimetici della proteina G influenzano gli stati esposti di ICL3 per attivare allostericamente il recettore. I nostri risultati rivelano inoltre che ICL3 regola la specificità del segnale inibendo l'accoppiamento del recettore con i sottotipi di proteina G che si accoppiano debolmente al recettore. Nonostante la diversità di sequenza di ICL3, dimostriamo che questo meccanismo di selezione della proteina G negativa attraverso ICL3 si estende ai GPCR attraverso la superfamiglia, espandendo la gamma di meccanismi noti mediante i quali i recettori mediano la segnalazione selettiva del sottotipo di proteina G. Inoltre, i nostri risultati collettivi suggeriscono ICL3 come sito allosterico per ligandi specifici del recettore e del percorso di segnalazione.

L’accumulo di dati strutturali consente sempre più la mappatura a risoluzione atomica dei meccanismi di attivazione dei GPCR. Questo dettaglio accurato può essere utilizzato per progettare agenti terapeutici che prendono di mira specifici GPCR implicati in diversi stati patologici8. Sebbene l'attivazione del GPCR sia meglio compresa attraverso i cambiamenti conformazionali nelle sette eliche transmembrana del recettore, anche i domini terminali e ad anello che collegano queste eliche sono fondamentali per la funzione e la regolazione del recettore in un contesto cellulare9. A causa dell’inaccessibilità di queste regioni ai metodi strutturali tradizionali, mancano informazioni su come contribuiscono ai meccanismi di segnalazione GPCR. La caratterizzazione mirata delle dinamiche di queste regioni migliorerebbe la nostra comprensione dei loro ruoli nella segnalazione GPCR, con il potenziale per identificare nuove strategie terapeutiche4.

Qui ci concentriamo su ICL3, che è il più grande dei tre circuiti intracellulari in molti GPCR di classe A, con dimensioni comprese tra 10 e 240 aminoacidi. ICL3 collega le eliche transmembrana cinque e sei, che sono responsabili dei cambiamenti strutturali tra lo stato inattivo e quello attivo del recettore, ed è adiacente al sito di legame dell'effettore di segnalazione del recettore10. La posizione fisica di ICL3 corrobora un ampio corpo di studi sulla mutagenesi che coinvolgono questa regione nell'attivazione e nella segnalazione dei recettori (Tabella supplementare 1). Tuttavia, i cambiamenti nella farmacologia dei recettori in seguito alla mutagenesi di ICL3 variano ampiamente tra i recettori, nonché tra le posizioni dei siti mutati sui singoli recettori (Dati estesi Fig. 1). Data questa mancanza di consenso, i meccanismi attraverso i quali ICL3 influenza l’attivazione dei recettori attraverso i recettori rimangono poco compresi. Ciò è esacerbato dalla diversità di sequenza di ICL3, anche tra recettori strettamente correlati11. Inoltre, il disordine intrinseco previsto e la mancanza di risoluzione strutturale di ICL3 nella maggior parte delle strutture pubblicate limitano la caratterizzazione struttura-funzione12. In questo studio, affrontiamo questa lacuna di conoscenza avanzando un quadro concettuale fondamentale per il ruolo di ICL3 nella segnalazione GPCR.

Abbiamo concentrato il nostro studio meccanicistico iniziale su ICL3 di β2AR, un prototipo strutturale per lo studio GPCR13. La modellazione molecolare di β2AR suggerisce che il suo ICL3 può accumularsi nella cavità intracellulare del recettore, regolando potenzialmente l'attivazione degli effettori di segnalazione a valle del recettore5. È stato proposto che questa conformazione compattata di ICL3 comunichi allostericamente con il dominio extracellulare del recettore, portando a uno stretto coordinamento tra lo stato di attivazione del recettore e la conformazione di ICL314. Parallelamente, la mutagenesi di ICL3 altera la dinamica conformazionale del recettore, come misurato utilizzando la spettroscopia 19F-NMR6. Con queste intuizioni come base, abbiamo mirato a costruire un modello meccanicistico per la funzione ICL3 nell'attivazione e nella segnalazione di β2AR determinando il suo insieme conformazionale.