La trasposizione della sequenza di inserzione inattiva CRISPR

Nature Communications volume 14, numero articolo: 4366 (2023) Citare questo articolo

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I sistemi immunitari CRISPR-Cas salvaguardano i genomi procariotici inibendo l’invasione di elementi genetici mobili. Qui, abbiamo esaminato sequenze genomiche procariotiche e identificato molteplici trasposizioni naturali di sequenze di inserzione (IS) in geni cas, inattivando così le difese CRISPR-Cas. Abbiamo quindi generato un sistema di intrappolamento degli IS, utilizzando ceppi di Escherichia coli con vari IS e una nucleasi cas inducibile, per monitorare gli inserimenti di IS nei geni cas in seguito all'induzione della rottura del DNA a doppio filamento come stress fisiologico dell'ospite. Abbiamo identificato più eventi mediati da diversi IS, in particolare IS1 e IS10, mostrando una specificità target sostanzialmente rilassata. La trasposizione dell'IS nel cas è stata mantenuta in presenza di macchinari di riparazione del DNA ed è stata rilevata anche la trasposizione in altri sistemi di difesa dell'ospite. I nostri risultati evidenziano il potenziale degli IS nel contrastare l’attività CRISPR, aumentando così la suscettibilità batterica all’invasione del DNA estraneo.

L'acquisizione di DNA estraneo mediante trasferimento orizzontale, come i geni per la resistenza agli antibiotici, può aumentare la fitness batterica1,2. Tuttavia, i procarioti dispongono anche di meccanismi di difesa per contrastare l’invasione di virus e altri parassiti genetici3,4. I sistemi clusterizzati di ripetizioni palindromiche brevi interspaziate regolarmente (CRISPR)/Cas sono un meccanismo di difesa dominante che protegge i procarioti da elementi genetici invasivi attraverso l'uso di specifici RNA guida (crRNA) generati dall'array CRISPR, una banca di sequenze di DNA inserite nell'ospite genoma e derivato da materiale genetico estraneo5,6. I crRNA “programmano” la proteina associata a CRISPR (Cas) per legare e scindere sequenze bersaglio complementari alla sequenza crRNA7. Sulla base degli effettori Cas distintivi e delle proprietà meccanicistiche, i sistemi CRISPR/Cas sono attualmente classificati in due classi e sei tipi8. L'endonucleasi SpCas9 di tipo II-A dello Streptococcus pyogenes ospita due domini nucleasici, RuvC e HNH, che possono scindere rispettivamente il filamento non bersaglio e il filamento bersaglio9,10. Anche i sistemi immunitari innati di restrizione-modificazione (RM)11 limitano il parassitismo genetico così come altri elementi di difesa procariotici, come i sistemi di infezione abortiva12 e i sistemi tossina-antitossina13.

Tuttavia, nonostante il sistema immunitario, le sequenze di inserzione (IS) e altri elementi genetici mobili (MGE) mediano ancora ampiamente il trasferimento genico orizzontale tra le specie14,15. Gli IS, gli MGE altamente diffusi in natura, sono geneticamente compatti, fiancheggiati da ripetizioni terminali invertite e generalmente elementi mobili fenotipicamente criptici che codificano solo trasposasi per facilitarne il movimento, il che in genere si traduce in duplicazioni del sito target (TSD) di lunghezza variabile che fiancheggiano l'inserzione siti16,17. A causa della loro trasposizione casuale e del potenziale di ricombinazione omologa tra due copie IS identiche, gli IS possono talvolta avere effetti deleteri sull'ospite18,19. Tuttavia, gli IS, in particolare nei trasposoni compositi, possono anche fornire alcuni vantaggi in termini di sopravvivenza all’ospite, anche modulando il metabolismo20, facilitando la riparazione del DNA21 e migliorando la virulenza e la resistenza antimicrobica22,23. Pertanto, la trasposizione dell'IS nell'ospite può contribuire alla sopravvivenza reciproca.

I sistemi di difesa CRISPR-Cas sono un’arma a doppio taglio poiché possono potenzialmente danneggiare il DNA estraneo benefico proteggendo l’ospite e, occasionalmente, è stata osservata l’abrogazione dei sistemi CRISPR-Cas da parte degli MGE. Ad esempio, il profago può integrarsi nelle sequenze di array CRISPR24 e l'inserimento dell'IS nei loci CRISPR è stato osservato in determinate condizioni ambientali25, generando suscettibilità alla predazione genetica.

In questo lavoro, la nostra prospezione iniziale rivela diverse occorrenze di inserimenti di IS nei geni cas, che probabilmente determinano l'abrogazione dei sistemi immunitari CRISPR in molti procarioti. Ipotizziamo che il collasso del meccanismo CRISPR potrebbe aumentare la suscettibilità dell'ospite agli MGE stranieri benefici, facilitando così l'acquisizione di tratti vantaggiosi e consentendo un adattamento efficace alle sfide ambientali. Utilizzando Escherichia coli come telaio, dimostriamo un'interazione tra i macchinari CRISPR-Cas e gli IS che modula l'idoneità dell'ospite attraverso l'interruzione di CRISPR-Cas, innescata dalle rotture del doppio filamento del DNA (DSB). Sorprendentemente, attraverso la mutagenesi iterativa dei siti bersaglio IS nei geni cas, IS1 e IS10 emergono come attori importanti nell'alterazione dei geni cas in E. coli DH10B, dimostrando la loro sostanziale flessibilità nel riconoscere i siti bersaglio. Inoltre, la trasposizione dell'IS in CRISPR-Cas è sostenuta durante l'introduzione di sistemi di riparazione di end-joining (NHEJ) non omologhi e l'analisi del genome mining indica che gli IS interrompono altri sistemi di difesa procariotici. Questi risultati dimostrano i ruoli chiave degli IS nel contrastare l’attività di CRISPR-Cas e altri meccanismi di difesa genetica nei procarioti.