Quantificazione dell'attività metabolica di Ascaris suum L3 mediante riduzione della resazurina

Parassiti e vettori volume 16, numero articolo: 243 (2023) Citare questo articolo

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Le infezioni da elminti rappresentano un importante problema di salute pubblica per l’uomo e hanno un impatto ancora maggiore sul benessere degli animali domestici e del bestiame. Le letture attuali per i test di screening dei farmaci antielmintici indicano lo stadio di sviluppo, la migrazione o la motilità che può essere soggettiva, laboriosa e con una produttività ridotta. Lo scopo di questo studio era di applicare e ottimizzare una tecnica fluorimetrica utilizzando la resazurina per valutare i cambiamenti nell'attività metabolica delle larve del terzo stadio di Ascaris suum (L3), un parassita di elevata rilevanza economica nei suini.

Ascaris suum L3 sono state schiuse meccanicamente da uova embrionate di 6-8 settimane e arricchite con gradiente di saccarosio. Il colorante di resazurina e A. suum L3 sono stati titolati in piastre di microtitolazione da 96 pozzetti e l'attività di riduzione della resazurina è stata valutata mediante fluorometria dopo 24 ore di incubazione. La microscopia a fluorescenza è stata utilizzata per localizzare il sito di riduzione della resazurina all'interno delle larve. Infine, abbiamo esposto A. suum L3 a varie condizioni di stress tra cui calore, metanolo e antielmintici e abbiamo studiato il loro impatto sul metabolismo larvale attraverso l'attività di riduzione della resazurina.

Mostriamo che la resazurina colorante non fluorescente viene ridotta all'interno del vitale A. suum L3 in resorufina fluorescente e rilasciata nei terreni di coltura. I parametri ottimali del test sono 100–1000 L3 per pozzetto, una concentrazione di resazurina di 7,5 µg/ml e un'incubazione a 37 °C/5% CO2 per 24 ore. Una guaina L2 intatta attorno alla L3 di A. suum impedisce completamente l'assorbimento di resazurina, mentre in L3 sguainata il segnale di fluorescenza più intenso si osserva lungo l'intestino medio della larva. L3 esposti al metanolo o al calore mostrano un'attività di riduzione della resazurina gradualmente diminuita. Inoltre, l'esposizione per 24 ore a ivermectina a 0,625 µM, mebendazolo a 5 µM e tiabendazolo da 10 a 100 µM hanno ridotto significativamente l'attività metabolica larvale rispettivamente del 55%, 73% e dal 70% all'89%.

Insieme, i nostri risultati mostrano che sia i fattori di stress metabolico che i farmaci antielmintici riducono in modo significativo e riproducibile l’attività di riduzione della resazurina di A. suum L3, rendendo il test proposto un metodo sensibile e facile da usare per valutare l’attività metabolica di A. suum L3 in vitro .

Il controllo dei nematodi gastrointestinali si basa principalmente sulla chemioterapia sia negli esseri umani che negli animali. Tuttavia, i trattamenti ricorrenti e le reinfezioni, la limitazione delle classi di farmaci antielmintici attualmente disponibili [49], le crescenti segnalazioni di ridotta efficacia dei farmaci e l’evoluzione della resistenza agli antielmintici di prima linea come i benzimidazoli e l’ivermectina aumentano la consapevolezza dell’importanza della ricerca sui farmaci antielmintici [19, 22 , 30, 38]. La rapida scoperta di nuovi farmaci contro gli elminti trasmessi dal suolo (STH) è ostacolata principalmente dalla mancanza di metodi oggettivi di screening ad alto rendimento per valutare l’efficacia dei farmaci [1, 20, 47].

La valutazione microscopica della motilità e della morfologia domina i metodi attualmente utilizzati per valutare l'efficacia dei farmaci nelle larve. Questi approcci in generale richiedono molto tempo, sono laboriosi e soggetti a soggettività, quindi non adatti allo screening ad alto rendimento. Dispositivi come xCELLigence System [40] e wMicroTracker System™ [24, 37] sono stati convalidati per lo screening farmacologico ad alto rendimento con Caenorhabditis elegans e alcune specie di elminti parassiti, ma la lettura è limitata interamente all'attività di locomozione. Pertanto, vengono discussi approcci combinatori che affrontano più parametri durante lo screening di nuovi farmaci candidati, come una lettura generale come l'attività di locomozione combinata con una lettura specifica per la presunta modalità di azione, come l'attività elettrofisiologica o metabolica [12].

Oltre alla motilità, la vitalità dei nematodi può essere valutata utilizzando coloranti indicatori dell'attività metabolica che vengono convertiti dagli stadi larvali in un prodotto misurabile. Diversi indicatori metabolici sono stati testati per gli elminti, come il colorante di tetrazolio 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), fluoresceina diacetato (FDA), para-nitrofenil fosfato (pNPP ) [34] e il colorante permeabile alle cellule resazurina. La resazurina si basa sulla riduzione NADPH-dipendente della resazurina in resorufina ed è ampiamente utilizzata per monitorare la crescita delle cellule dei mammiferi e il metabolismo cellulare in un'ampia gamma di bersagli [23]. Il test di riduzione della resazurina è stato finora adattato per lo screening farmacologico nelle specie adulte di Schistosoma [25, 26] e nelle larve di quarto stadio (L4) e negli adulti di Trichuris muris [39]. Per quanto a nostra conoscenza, i dati sul potenziale del test di riduzione della resazurina in Ascaris spp. mancano i parassiti, sebbene sia uno degli STH più comuni a livello mondiale sia nell’uomo che nei suini [15, 17, 51].

95%. Of note, larvae inside eggs that we obtained from both the 23% and 25% sucrose layers appeared fully embryonated and were therefore pooled and used for all subsequent in vitro assays./p> 0.99). For larvae treated with 1.5 vol% methanol for 24 h, no significant impact on resazurin reduction activity was detected. However, gradual impairment of resazurin reduction activity was observed at concentrations of 3%, 6%, and 12%, resulting in significantly weaker fluorescence signals by 20% (P ≤ 0.05), 45% (P ≤ 0.0001), and 70% (P ≤ 0.0001), respectively. Methanol at 25% completely abrogated resazurin reduction. In the control, methanol itself at concentrations of 25% did not notably change fluorescence characteristics of resorufin (Additional file 2: Fig. S2). A gradual decrease in resorufin production was measured with increasing methanol concentrations. Four-parameter logistic regression revealed a half-maximal effective concentration (EC50) = 6.8% (df = 26, R2 = 0.95, 95% CI for EC50 = 4.3–9.2%) for methanol (Additional file 3: Fig. S3). Overall, for A. suum L3 exposed for increasing times to 60 °C or increasing methanol concentrations, we observed a gradually measurable decrease in resazurin reduction activity in the larvae./p>

1.14 mM in A. suum L4 (intestinal isolates 14 days post-infection). However, we were not able to reproduce an ivermectin concentration of 1.14 mM without precipitation of the drug in 0.5% DMSO. Therefore, we titrated ivermectin in 0.5% DMSO (in H2O) and detected turbidimetrically its maximum solubility at 1.56 µM in H2O (Additional file 4: Table S1). Moreover, the solubility of ivermectin in HBSS-AB was lower due to medium components like salts, sugar and antibiotics, which reduced the maximum soluble concentration to 625 nM. At this concentration of ivermectin, we observed 55% reduction in the activity of resazurin reduction in the L3, which consequently indicates a considerably lower EC50 value for A. suum L3 than for A. suum L4 observed by Hu et al. [16]. Hansen et al. [14] reported for ivermectin an IC50 of ~ 1 µM in A. suum L3, which is closer to our observations. However, for C. elegans, significant effects were observed at considerably lower ivermectin concentrations (0.6–20 nM ivermectin) [3, 12]. On the one hand, this may indicate that the resazurin reduction assay is less sensitive for detecting the effects of ivermectin on A. suum L3 compared to in vitro assays in other nematodes. On the other hand, together with the observations from Hu et al. [16] and Hansen et al. [14], it is conceivable that A. suum larvae are less susceptible to ivermectin than C. elegans larvae. The impact of thiabendazole and mebendazole on A. suum L3 have been investigated so far by Zhao et al. [50], who reported an EC50 values in the range of 2.3–150 nM using an agar migration assay for drug effect evaluation after 24 h drug treatment. However, 1000-fold higher concentrations of these anthelmintics resulted in significant but not complete inactivation of resazurin reduction activity by 73% to 89% in the present study. The direct comparison of the studies is difficult because the drug effects were evaluated using different methods. However, the resazurin reduction assay might be less sensitive in detecting impairments of larval locomotion rather than the agar migration assay but might provide a better sensitivity for detecting impairments of larval metabolic activity./p>

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