Lo screening funzionale genotipizzato dei cloni Fab solubili consente di ottenere

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13107 (2023) Citare questo articolo

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Gli anticorpi monoclonali (mAb) e i loro frammenti sono ampiamente utilizzati in ambito terapeutico, diagnostico e nella ricerca di base. Sebbene i metodi di visualizzazione come la visualizzazione dei fagi offrano un rendimento elevato, le affinità dei singoli anticorpi devono essere misurate accuratamente in formato solubile. Abbiamo sviluppato una piattaforma di screening in grado di fornire dati funzionali genotipizzati da un totale di 9216 cloni solubili e individuali di frammenti leganti l'antigene (Fab) impiegando il sequenziamento di prossima generazione (NGS) con indicizzazione gerarchica. Sequenze di domini variabili accoppiati a lunghezza intera (VL-VH) sono collegate ai dati di screening funzionale, consentendo un'analisi approfondita degli effetti della mutazione. La piattaforma è stata applicata a quattro progetti di screening scFv/Fab selezionati tramite visualizzazione dei fagi e a un progetto di maturazione dell'affinità VH con saturazione del sito. Lo screening funzionale genotipizzato ha consentito contemporaneamente l'identificazione di mutazioni che migliorano l'affinità nel dominio VH di Fab 49A3 riconoscendo il sierotipo 2 della proteina non strutturale 1 (NS1) del virus della dengue e ha fornito informazioni sulle posizioni dei residui VH che non possono essere modificate dal tipo selvaggio senza diminuire l'affinità. L'identificazione basata sul genotipo ci ha rivelato l'entità della varianza del segnale intraclonale inerente ai dati di screening a punto singolo, un fenomeno spesso trascurato sul campo. Inoltre, lo screening genotipizzato ha eliminato la selezione ridondante di genotipi identici per ulteriori studi e ha fornito un nuovo strumento di analisi per valutare il successo delle selezioni di phage display e la restante diversità clonale nei repertori sottoposti a screening.

L’ingegneria degli anticorpi ricombinanti è una storia di successo nel campo della biotecnologia. Gli anticorpi monoclonali (mAb) e i loro frammenti, come il frammento variabile a catena singola (scFv) e il frammento legante l'antigene (Fab), sono ampiamente utilizzati in ambito terapeutico, diagnostico e come strumenti per la ricerca di base1. Man mano che vengono scoperte nuove molecole bersaglio per queste applicazioni, sono necessari leganti nuovi o migliorati con elevata affinità, specificità e proprietà fisico-chimiche desiderate.

La dimensione più piccola dei frammenti anticorpali e la mancanza del dominio Fc offre numerosi vantaggi rispetto alle IgG a grandezza naturale, tra cui una migliore penetrazione nei tessuti2,3 e una minore possibilità di interferenza nei test diagnostici in vitro4. Dal punto di vista dell'ingegneria degli anticorpi, il vantaggio principale della struttura semplice dei frammenti di anticorpi è la loro espressione economica e facile in E. coli, che ne consente l'uso nella visualizzazione dei fagi5. Le tecnologie avanzate delle librerie genetiche degli anticorpi ricombinanti6,7 combinate con metodi di visualizzazione ad alto rendimento offrono un modo efficiente per arricchire i leganti contro un'ampia varietà di bersagli8.

Sebbene i metodi di visualizzazione abbiano una produttività elevata, l'affinità e la specificità dei singoli leganti devono essere valutate mediante screening di un gran numero di singoli anticorpi in formato solubile. In alcuni studi è stata segnalata una perdita di specificità dopo che i frammenti di anticorpi visualizzati sui fagi sono stati convertiti in formato solubile9,10. Ciò potrebbe essere spiegato dall'alterata conformazione dell'scFv dopo aver perso il supporto della proteina pIII, che è il partner di fusione più comune dell'scFv per la visualizzazione10. Esistono anche segnalazioni di perdita di affinità dopo la conversione diretta dal formato scFv al formato IgG11,12, che limita notevolmente le aree di applicazione degli anticorpi scoperti. Inoltre, la multimerizzazione involontaria degli scFv porta a un legame più forte attraverso effetti di avidità, che non è desiderato nel panning o nello screening solubile13,14. I Fab, tuttavia, sono generalmente considerati come molecole monomeriche che rappresentano il formato di screening ideale per i test di affinità e, sebbene non si possa escludere l'esistenza di particelle fagiche con più Fab visualizzati, il rischio di arricchimento dovuto agli effetti di avidità è inferiore con Fab rispetto a scFv librerie di fagi13. Oltre alla stima affidabile dell'affinità, lo screening solubile consente l'identificazione di cloni con buoni livelli di espressione.

3) among the phage display selected libraries. Among genotypes encountered at least three times in the screening campaign, 66.7% did not bind to the SpyCatcher-antigen (S/B < 3), whereas, of the remaining genotypes, 28.9% showed S/B-ratio both above and below the set threefold threshold ratio, and 4.4 % were positive (S/B > 3) in all instances (6.7% if calculated by S/B > 2). On the contrary, anti-DARPin library was over enriched in relation to the number of clones screened, with only 76 unique genotypes, 43% of which were represented between 2 and 331 times with a standard deviation (SD) of 47. Three genotypes, including one used as control, were present with 170 clones or more. The low number of unique clones in the anti-DARPin Fab repertoire is consistent with the selection scheme, as four rounds of Fab-phage selections were carried out with the anti-DARPin library in contrast to three with anti-SpyC library and one to two with anti-NP libraries. The genotype copy numbers per library are shown in Fig. 2b./p> 3) and distribution of functional screening data differed between the phage-derived screening projects. Despite undergoing 4 + 4 rounds of phage display, it appears that the anti-SpyCatcher library was not fully enriched and could have potentially benefited from an additional round of phage display selection or a reconsideration of the selection strategy. The selection campaign involved various antigens, including chemically biotinylated SpyCatcher, scFv-SpyCatcher, and in vivo biotinylated Spy- and SdyCatcher proteins, aiming to enhance binding towards the catcher rather than the SA-biotin linker. The insufficient enrichment is evidenced by the low number of identical genotypes in the screened set and a relatively low hit rate of 13%. Low hit rate can also be seen in the distribution of the functional signal data (Fig. 2), which is heavily bottom weighted. In the remaining three projects, the hit rates were higher and also the shared genotypes more abundant. In the case of the anti-DARPin library the selection could have been screened after the 3rd round instead of the 4th round of panning, as only a few genotypes were represented in the data, which also had a quite evenly distributed functional signal. NP-1 and NP-2 both come from the same Fab-converted phage library origin, but the functional data between them is very different, with NP-2 having more evenly distributed signals between clones. This was expected, as the last two selection rounds and assay formats were different. NP-2 Fabs were first bound on the wells, followed by addition of biotinylated antigen and detected with Eu-labeled streptavidin, whereas NP-1 Fabs were selected to bind antigen captured by the control Fab N1G1, and the presence of E. coli-expressed Fab-APs was detected with europium-labeled anti-alkaline phosphatase antibody./p>